單細胞轉(zhuǎn)錄組測序
近年來，隨著科學技術(shù)水平的更新?lián)Q代，越來越多的單細胞技術(shù)得到了發(fā)展。如人類細胞圖譜、小鼠細胞圖譜、小鼠RNA圖譜、小鼠ATAC圖譜和植物細胞圖譜等大型項目，已經(jīng)產(chǎn)生了大量單細胞組學數(shù)據(jù)。通過空間轉(zhuǎn)錄組學和單細胞多組學，甚至可以解讀空間動態(tài)多級調(diào)控機制。這些單細胞技術(shù)在腫瘤學、輔助生殖、胚胎發(fā)育和植物育種等領域有許多成功的應用。單細胞測序通常包括單細胞基因組測序，單細胞表觀測序，以及單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。我們這里以單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）為例來給大家進行介紹。
單細胞測序的應用
在已經(jīng)擁有RNA-Seq測序技術(shù)的前提下，我們?yōu)槭裁催€要進行單細胞測序？單細胞測序技術(shù)之所以重要并被廣泛研究和應用，主要是因為它具有以下幾個關鍵的優(yōu)勢和目的：
? 揭示細胞異質(zhì)性：在傳統(tǒng)的群體細胞測序中，只能獲得細胞群體的平均基因表達水平，這會掩蓋細胞間的個體差異。單細胞測序可以揭示細胞群體內(nèi)部的異質(zhì)性，識別不同的細胞亞群和狀態(tài)。
? 深入理解疾病機制：單細胞測序有助于深入理解復雜疾病的發(fā)病機制，如腫瘤的微環(huán)境、不同細胞類型的相互作用以及疾病進展過程中的細胞動態(tài)變化。
? 精確診斷和治療：通過對單個細胞的基因表達和遺傳變異進行分析，可以為疾病提供更精確的診斷，并有助于開發(fā)個性化的治療方案。
? 細胞發(fā)育和分化研究：單細胞測序技術(shù)可以追蹤細胞分化過程中的基因表達變化，揭示干細胞分化為特定細胞類型的分子機制。
? 免疫學研究：單細胞測序有助于研究免疫細胞的多樣性和功能，理解免疫應答的復雜性，為疫苗開發(fā)和免疫治療提供信息。
? 神經(jīng)科學：在神經(jīng)科學領域，單細胞測序可以揭示不同類型神經(jīng)元的基因表達特征，增進對大腦功能和神經(jīng)退行性疾病的理解。
? 微生物群落研究：單細胞測序技術(shù)可以分析微生物群落中的物種多樣性和功能，有助于環(huán)境科學和生態(tài)學研究。
? 提高研究分辨率：單細胞測序提供了一種高分辨率的方法來研究生物學問題，可以觀察到傳統(tǒng)方法無法檢測到的細微變化。
? 發(fā)現(xiàn)新的生物標記物：通過分析單個細胞的基因表達，可以發(fā)現(xiàn)與疾病相關的新的生物標記物，為早期診斷和治療提供可能。
? 推動精準醫(yī)療：單細胞測序技術(shù)的發(fā)展推動了精準醫(yī)療的進步，使得醫(yī)療干預可以更精確地針對個體的細胞特征。
總之，單細胞測序技術(shù)因其能夠提供細胞層面的詳細和全面信息，已成為現(xiàn)代生物學和醫(yī)學研究中不可或缺的工具。研究單細胞測序的方法有很多，每種單細胞測序技術(shù)的實驗流程都有其特定的步驟和特點。我們通過以下是幾種常見單細胞測序技術(shù)來為大家進行相應的介紹：
? Smart-seq2
★ 原理：對單個細胞的mRNA進行全轉(zhuǎn)錄組的擴增和測序。
★ 優(yōu)點：提供全長轉(zhuǎn)錄組信息，適合于低通量、高精度的研究。
★ 缺點：通量較低，成本較高，不適合大規(guī)模樣本分析。
★ 應用場景：適用于需要全長mRNA信息的研究，如可變剪接事件分析、小樣本量的細胞狀態(tài)研究。
SMART-Seq2實驗原理
? 10X Genomics Chromium
★ 原理：基于微流控技術(shù)和油包水乳液的微滴技術(shù)，每個微滴包含一個細胞和反應所需的組分，進行cDNA合成和擴增。
★ 優(yōu)點：高通量，可同時處理大量細胞；使用UMI技術(shù)，減少PCR擴增偏倚。
★ 缺點：成本較高；數(shù)據(jù)量較大，需要較強的計算資源。
★ 應用場景：適用于需要大規(guī)模單細胞分析的研究，如腫瘤異質(zhì)性、免疫細胞狀態(tài)分析等。
★ 實驗流程：
1. 細胞分離與裝載：將單個細胞分離并通過微流控技術(shù)裝載到芯片上。
2. 乳液滴生成：形成油包水乳液滴，每個乳液滴包含一個細胞和反應組分。
3. 細胞裂解與cDNA合成：在乳液滴內(nèi)進行細胞裂解和cDNA合成。
4. 文庫構(gòu)建：cDNA進行擴增和標記，構(gòu)建測序文庫。
5. 測序：使用Chromium平臺和Illumina測序技術(shù)進行測序。
6. 數(shù)據(jù)分析：包括數(shù)據(jù)解包、比對、定量、聚類分析等。
10× Genomics實驗原理
? Drop-seq
★ 原理：使用微流控技術(shù)，將單個細胞與微珠結(jié)合，微珠帶有獨特的barcode，用于區(qū)分不同細胞的mRNA。
★ 優(yōu)點：高通量，成本效益高；適用于稀有細胞類型的分析。
★ 缺點：可能存在較高的dropout率（在單細胞測序（single-cell sequencing）中，"Dropout"率是指在測序過程中，由于各種原因?qū)е履承┗蚧蜣D(zhuǎn)錄本沒有被檢測到的現(xiàn)象。），即某些基因在測序中未被檢測到。
★ 應用場景：適合于大規(guī)模的細胞狀態(tài)和類型的分類研究。
★ 實驗流程：
1. 細胞懸液制備：制備細胞懸液并通過微流控技術(shù)進行操作。
2. 微珠裝載：細胞與帶有獨特barcode的微珠結(jié)合。
3. 乳液滴生成：形成包含細胞和微珠的乳液滴。
4. 細胞裂解與cDNA合成：在乳液滴內(nèi)進行細胞裂解和cDNA合成。
5. 文庫構(gòu)建與擴增：構(gòu)建測序文庫并進行PCR擴增。
6. 高通量測序：進行高通量測序。
7. 數(shù)據(jù)分析：包括barcode解復用、比對、定量、聚類分析等。
Drop-seq實驗原理
? Micro-well
★ 原理：通過微孔板技術(shù)，每個微孔捕獲一個細胞，進行細胞裂解和cDNA合成。
★ 優(yōu)點：操作簡便，成本相對較低。
★ 缺點：通量受限于微孔板的孔數(shù)，不適合超大規(guī)模樣本。
★ 應用場景：適合于中小規(guī)模的單細胞測序，如特定細胞類型的功能研究。
★ 實驗流程：
1.細胞懸液制備：制備細胞懸液。
2.細胞分配：將細胞分配到微孔板的每個孔中，理想情況下每個孔一個細胞。
3.細胞裂解與cDNA合成：在孔中進行細胞裂解和cDNA合成。
4.文庫構(gòu)建：構(gòu)建測序文庫。
5.高通量測序：進行高通量測序。
6.數(shù)據(jù)分析：包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、定量、差異表達分析等。
Micro-well實驗原理
? SPLiT-seq
★ 原理：結(jié)合了微流控技術(shù)和微孔技術(shù)，通過物理分割單個細胞，進行測序。
★ 優(yōu)點：適用于有限的細胞數(shù)量，可以結(jié)合細胞表面標記進行分析。
★ 缺點：技術(shù)操作復雜，需要特定的設備和條件。
★ 應用場景：適用于有限數(shù)量的細胞樣本，需要結(jié)合細胞表面標記的研究。
★ 實驗流程：
1.細胞懸液制備：制備細胞懸液。
2.細胞分配：將細胞分配到微孔板的每個孔中。
3.物理分割：物理分割每個孔以確保每個孔中只有一個細胞。
4.細胞裂解與cDNA合成：在孔中進行細胞裂解和cDNA合成。
5.文庫構(gòu)建：構(gòu)建測序文庫。
6.高通量測序：進行高通量測序。
7.數(shù)據(jù)分析：進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、定量和聚類分析。
SPLiT-seq實驗原理
? MARS-seq
★ 原理：基于微流控技術(shù)，通過微滴包裹單個細胞，進行mRNA捕獲和測序。
★ 優(yōu)點：能夠提供單細胞水平的基因表達數(shù)據(jù)。
★ 缺點：可能存在較高的drop out率和基因檢測的不穩(wěn)定性。
★ 應用場景：適用于需要中等通量單細胞測序的研究。
★ 實驗流程：
1.細胞懸液制備：制備細胞懸液。
2.微流控技術(shù)：使用微流控技術(shù)將單個細胞封裝在微滴中。
3.細胞裂解與cDNA合成：在微滴中進行細胞裂解和cDNA合成。
4.文庫構(gòu)建：構(gòu)建測序文庫。
5.高通量測序：進行高通量測序。
6.數(shù)據(jù)分析：進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、定量和聚類分析。
MARS-seq實驗原理
每種技術(shù)的實驗流程都旨在從單個細胞中獲取遺傳信息，并將其放大到足以進行高通量測序的水平。數(shù)據(jù)分析是單細胞測序的關鍵部分，需要專業(yè)的生物信息學工具和方法來處理和解釋大量的數(shù)據(jù)。
Smart-seq2技術(shù)作為常用的單細胞RNA測序技術(shù)之一，它具有一些獨特的優(yōu)勢，這些優(yōu)勢在某些研究場景中具有不可替代性：
1.全長轉(zhuǎn)錄組測序：
Smart-seq2可以提供單個細胞的全長cDNA序列，這意味著可以獲得完整的mRNA信息，包括所有外顯子和剪接變體。這對于鑒定和分析可變剪接事件至關重要。其他技術(shù)可能只能提供部分轉(zhuǎn)錄本信息，無法全面了解剪接模式。
2.低dropout率：
相比于一些基于標簽的方法（如Drop-seq或10X Genomics），Smart-seq2通常具有更低的dropout率，這意味著較少的基因表達信息在測序中被遺漏。在研究稀有細胞類型時，確保所有基因表達事件都能被捕獲是非常重要的。Smart-seq2較低的dropout率意味著即使是低豐度的轉(zhuǎn)錄本也更有可能被檢測到。
3.適用于稀有或珍貴樣本：
由于Smart-seq2可以提供高質(zhì)量的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，它特別適合用于那些難以獲得大量細胞或樣本非常珍貴的研究。
4.高靈敏度和準確性：
Smart-seq2技術(shù)能夠檢測到低豐度的轉(zhuǎn)錄本，并且由于其較低的dropout率，它在定量基因表達方面具有較高的準確性。
5.可變剪接分析：
由能夠獲得完整的轉(zhuǎn)錄本序列，Smart-seq2特別適合于研究可變剪接事件，這對于理解基因調(diào)控和功能至關重要。
6.適用于小規(guī)模樣本：
Smart-seq2技術(shù)適合于研究少量細胞，例如在研究特定類型的細胞或組織時，這可能是一個重要的優(yōu)勢。例如，可研究的神經(jīng)元樣本數(shù)量有限時，那么選擇一種能夠提供最全面信息的技術(shù)變得尤為重要。Smart-seq2適合這種情況，因為它可以從少量細胞中捕獲完整的轉(zhuǎn)錄組信息。
7.技術(shù)成熟：
Smart-seq2是一種較早開發(fā)的單細胞測序技術(shù)，因此擁有更多的文獻支持和成熟的實驗流程。
全式金生物推出的 TransNGS? Whole Transcriptome Amplification Kit（KC921）是一款能夠獲得單細胞全長 cDNA 擴增產(chǎn)物的試劑盒，以WTA Oligo(dT) 為逆轉(zhuǎn)錄引物，并應用合成效率高、且具有模板置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶在cDNA的3'端添加一段特殊序列，從而得到全長cDNA產(chǎn)物。一個單細胞文庫通常可以獲得10-60 ng的全長轉(zhuǎn)錄組擴增產(chǎn)物。
? 產(chǎn)品特點
? 細胞類型兼容性強，可適用于RNA含量較低的細胞（如免疫細胞）
? 組織類型兼容性強，可適用于較難解離的組織（如腦組織）
? 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量好，文庫產(chǎn)量高，峰型優(yōu)異，有效檢出基因（FPKM>1）的數(shù)目高
? 樣本兼容體積高達6 μl，可適配不同濃度RNA或不同數(shù)量細胞的擴增
? 操作時間短，約3小時即可完成文庫構(gòu)建
? 適用范圍
1-105個哺乳動物細胞或無細胞壁結(jié)構(gòu)的真核細胞（如原生質(zhì)體）
10 pg-100 ng總RNA（含有poly(A)序列的mRNA）
? 實驗數(shù)據(jù)
? 適用樣本類型廣泛
使用TransGen對6種不同類型細胞進行全長cDNA擴增，純化后Qubit測定文庫濃度，結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品適用于多種類型細胞，文庫產(chǎn)量均高于800 ng。
文庫產(chǎn)量高
文庫峰型好
使用TransGen對6種不同類型細胞進行全長cDNA 擴增，純化后Qsep100檢測文庫峰型，結(jié)果表明，文庫峰型覆蓋200-10000 bp，cDNA產(chǎn)物大小符合預期，峰型無異常。
測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高
使用TransGen對6種不同類型細胞進行全長擴增后進行Tn5建庫，結(jié)果表明，各類型細胞文庫測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，基因覆蓋度高，有效基因檢出數(shù)（FPKM>1）高。
| 樣品類型 | Q30 | Total mapped | GC | Exon |
| HeLa | 95.83% | 97.98% | 50.46% | 79.91% |
| CHO | 94.91% | 97.54% | 50.57% | 81.61% |
| Vero | 92.65% | 98.10% | 50.09% | 78.57% |
| B cell | 93.89% | 97.67% | 49.78% | 76.37% |
| T cell | 93.95% | 97.77% | 50.14% | 77.63% |
| NK cell | 93.92% | 97.58% | 49.39% | 75.99% |
有效基因檢出數(shù)（FPKM＞1）高
? 樣本投入量范圍廣
文庫產(chǎn)量高
使用TransGen對不同投入量的RNA和細胞樣本進行全長cDNA擴增，純化后Qubit測定文庫濃度，結(jié)果表明，不同投入量均可獲得較高的文庫產(chǎn)量，樣本投入量寬泛（10 pg-100 ng）。
文庫峰型好
使用TransGen對不同投入量的HeLa細胞 RNA樣品進行全長cDNA擴增， 純化后Qsep100檢測文庫峰型，結(jié)果表明，文庫峰型覆蓋200-10000 bp，cDNA產(chǎn)物大小符合預期，峰型無異常。
測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高
使用TransGen產(chǎn)品對不同投入量的HeLa細胞進行全長cDNA擴增后進行Tn5建庫，結(jié)果表明，不同投入量的TransGen產(chǎn)品在Q30、總比對率及平均有效基因數(shù)（gene FPKM >1）表現(xiàn)優(yōu)異，建庫效果好。
樣品投入量 | Q30 | Total mapped |
10 pg RNA | 95.63% | 97.64% |
100 pg RNA | 95.91% | 97.58% |
1 ng RNA | 95.78% | 98.23% |
10 ng RNA | 95.89% | 97.96% |
100 ng RNA | 95.95% | 98.07% |
樣品投入量 | Q30 | Total mapped |
1 cell | 94.76% | 98.42% |
10 cells | 95.08% | 98.16% |
100 cells | 95.23% | 98.05% |
1000 cells | 95.21% | 98.22% |
10000 cells | 95.13% | 98.65% |
有效基因數(shù)（FPKM>1）
? 與競品比較
文庫產(chǎn)量更高
使用 TransGen、Company V和Company N產(chǎn)品分別對10 ng RNA和100個HeLa細胞樣本進行全長cDNA擴增，純化后Qubit測定文庫濃度，結(jié)果表明，TransGen產(chǎn)品的文庫產(chǎn)量均高于競品。
文庫峰型更好
使用TransGen、Company V和Company N產(chǎn)品分別對10 ng和100個 HeLa細胞RNA樣品進行全長cDNA擴增，純化后Qsep100檢測文庫峰型，結(jié)果表明，文庫峰型覆蓋200-10000 bp，cDNA產(chǎn)物大小符合預期，峰型無異常。
測序數(shù)據(jù)質(zhì)量更高
使用TransGen、Company V和Company N產(chǎn)品分別對10 ng RNA和100個HeLa細胞進行全長cDNA擴增后進行Tn5建庫，結(jié)果表明，不同投入量的TransGen產(chǎn)品在Q30、總比對率及平均有效基因數(shù)（gene FPKM >1）表現(xiàn)優(yōu)異，建庫效果好。
樣品投入量 | 使用產(chǎn)品 | Q30 | Total mapped | GC | Exon |
10 ng RNA | TransGen | 93.65% | 98.21% | 93.65% | 98.21% |
Company V | 92.31% | 97.07% | 50.55% | 79.76% | |
Company N | 90.43% | 95.54% | 50.57% | 75.87% | |
100 cells | TransGen | 93.44% | 97.67% | 49.80% | 80.03% |
Company V | 91.88% | 96.84% | 49.93% | 78.35% | |
Company N | 90.50% | 95.23% | 50.64% | 77.26% |
有效基因數(shù)（FPKM>1）
10 ng RNA
100 cells
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 目錄號 | 規(guī)格 |
TransNGS? Single Cell Full Length cDNA Synthesis&Amplification Kit | KC901 | 12/24/96 rxns |
TransNGS? Whole Transcriptome Amplification Kit | KC921 | 12/96 rxns |
