Q：不酶切或酶切不完全
A:
? 酶失活或濃度過低：用已知含目的酶切位點的對照 DNA 測試該酶活性；酶應貯存于 -20℃，-70℃時會凍結(jié)；避免反復凍融降低酶活；可根據(jù)實驗要求適當加大酶
量。
? DNA 濃度不合適：推薦 50 μl 反應體系酶切 1-2 μg DNA；DNA 過量時可適當增加酶量。
? DNA 被抑制劑污染：與對照 DNA 樣品一起酶切，驗證其是否被抑制；重新純化 DNA 樣品。
? DNA 可能形成超螺旋：不同酶對超螺旋結(jié)構(gòu) DNA 消化效率不一樣，可適當加大酶量。
? 識別位點過于接近 DNA 末端：一般在識別位點兩端各加 6 個保護堿基可確保酶切效率。
? 識別位點不存在：驗證 DNA 序列。
? 反應條件非最優(yōu)化：緩沖液使用不當；按比例使用新鮮緩沖液重復實驗；按照推薦方案進行雙酶切或分步酶切。
? 甲基化封閉酶切位點：PCR 產(chǎn)物未甲基化；使用 dam-/dcm-菌株轉(zhuǎn)化。
Q：出現(xiàn)非預期帶型
A：
? 確定正確帶型：酶切產(chǎn)物與對照 DNA 樣品一起電泳，確定是未消化完的底物條帶或者是星號活性產(chǎn)生的非預期條帶。
? DNA 樣品污染：重新制備或純化樣品
? 含其它酶切位點：驗證 DNA 序列
Q：DNA 電泳呈彌散帶
A：
? 酶與 DNA 結(jié)合緊密未完全解離：使用隨酶提供的 DNA Loading Buffer 上樣電泳；或另加入終濃度為0.05-0.2% 的 SDS。
? 核酸酶污染：制備新的底物樣品；使用新的緩沖液和水。
? 電泳條件不合適：使用新鮮的電泳緩沖液和凝膠；合適的電流電壓避免過熱。
Q：星號活性 (特異性降低或改變)
A：
? 高甘油濃度 (>5% v/v)：酶儲存液含 50% 甘油；因此酶量不超過反應體積的10%。選擇 50 μl的標準反應體系，以減少反應過程中水的蒸發(fā)而提高甘油濃度。
? 非最適緩沖液：盡可能使用推薦緩沖液，離子濃度和 pH 的改變會引起星號活性。
? 存在有機溶劑 ( 如 DMSO、乙醇、DMF 等)：確保樣品在制備過程中不含任何有機物，如 DNA 制備過程中可能混入的乙醇。
? 混有其它二價離子 (如 Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+) 去除樣品中二價離子
